相比于普通的RNA-seq文库，链特异性RNA-seq保留了转录本的方向信息，可以确定reads是来源于正链或负链，使得基因定量和可变剪切事件检测更准确，对挖掘天然反义LncRNA的信息，分析基因结构及功能分析更有利。
那么有哪些方法可以实现链特异性文库构建？这些不同的方法分别适合哪类RNA样本建库呢？今天，小编将给大家进行详细解答
如何构建链特异性文库
目前链特异性文库的建库方法有很多种，主要分为2类。第一类是在RNA的3’和5’端加上不同的接头，2个不同的接头序列标记RNA的3’和5’端（图1A）。第二类依赖于化学修饰标记一条链，使得碱基发生变化或链被降解（图1B）。
不同RNA样本如何构建链特异性文库
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小RNA属于非编码核糖核酸（ncRNA），在基因调控中有重要的作用，包括miRNA/piRNA/tRF&tiRNA/tRNA/snRNA/snoRNA等。由于小RNA片段比较小，比如miRNA（17-25 nt），piRNA （24-35 nt），tRNA （60-95 nt），不适合使用随机引物合成cDNA（片段越小，随机引物可结合的位点越少）。
同时小RNA也不带有Poly （A）尾巴，无法使用Oligo dT引物合成cDNA。因此，Small RNA样本通常采用RNA ligation的方法在RNA的3’和5’端分别连接接头来构建链特异性文库。
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对于mRNA/LncRNA/CircRNA等通常大于200 nt，可以使用随机或Oligo dT引物合成cDNA第一链。在合成cDNA第二条链的时候加入dUTP，dUTP的链可以被酶消化或扩增的时候用不识别dUTP的聚合酶。
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对于一些难扩培的细胞或者从组织上直接分离下的少量细胞，如特殊的组织，血清/血浆以及外泌体等样本，能够获取的RNA总量可能在10 ng以下。
对于微量RNA链特异性转录组文库构建，通常使用SMART技术，通过随机或oligo dT引物（带一段接头序列），合成cDNA第一链，并在3’端加上三个C，进一步使用TSO ( template-switching oligo )引物通过链置换添加另一端接头序列，保留了RNA的链来源信息。
各种链特异性文库测序结果对比
研究者使用酿酒酵母转录组作为基准，比较了多种文库构建方法，发现在链特异性、文库复杂性、均一性和覆盖连续性、与已知注释一致性，及表达谱的准确性方面都存在显著差异。
通过权衡每种方法的性能和简易性，研究者认为dUTP二链标记方法最好，在单端和双端测序数据中Unique比例，5’和3‘端的转录本分布比例以及样本间重复性方面均比其它方法表现优异。
ABclonal 的RNA-seq链特异性文库构建试剂盒也是采用dUTP二链标记方法，确定转录本来源于正义链或反义链，更准确定量基因表达和可变剪切事件，提高反义转录本检出率和无参组装效率，获得最真实的样本转录信息。
ABclonal
公司简介
爱博泰克生物科技有限公司（ABclonal Technology Co.,Ltd.）成立于2011年，作为生命科学解决方案的提供商，旨在为更多的科研工作者、IVD企业、新技术开发企业提供抗体、酶、NGS产品和蛋白制品等全套解决方案。