如何提高微量样品成功率?揭秘DNA甲基化研究的幕后推手

cfDNA/ctDNA的甲基化检测越来越受到国内外多家癌症早筛公司的青睐。全基因组重亚硫酸盐测序(WGBS)是甲基化图谱分析的金标准,但重亚硫酸盐的化学反应会破坏和降解DNA,导致DNA断裂和丢失,不适合在珍稀样品(如cfDNA/ctDNA)中应用。

此外,重亚硫酸盐文库表现出明显的GC偏嗜性,并在甲基化区域尤为显著。为了克服这些局限性,人们开始关注酶法转化的方法。


ABclonal作为酶原料公司,设计优化蛋白酶的生产工艺,推出了关键酶原料—TET2, T4-BGT和APOBEC,为微量样本DNA甲基化研究提供了有利的酶工具。


TET2酶功能介绍

DNA去甲基化酶——DNA dioxidase(双加氧酶)TET家族蛋白自2009年发现以来,一直是表观遗传学领域最热门的明星蛋白之一,主要包括TET1/2/3。
TET蛋白催化活性依赖于Fe2+,搭配TET2 Reaction Buffer和Enhancer,可以快速高效地氧化DNA中的5mC和5hmC,即 5-甲基胞嘧啶(5mC)→5-羟甲基胞嘧啶(5hmC) →5-甲酰胞嘧啶(5fC)→5-羧基胞嘧啶 (5caC),是DNA去甲基化过程中的一种重要的酶,对于维持干细胞的多能性有重要作用。

T4-BGT酶功能介绍

T4噬菌体β-葡糖基转移酶 (T4-BGT) 具有很高的糖基转移酶活性。搭配Reaction Buffer和Enhancer,可以快速完整地将尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-葡萄糖)的葡萄糖基团转移至双链 DNA 中的5-羟甲基胞嘧啶 (5-hmC) 基团上,形成β-葡糖基-5-羟甲基胞嘧啶(5-ghmC),协助进行5-hmC的检测与分析。


APOBEC酶介绍

胞嘧啶脱氨酶(APOBEC)具有很高的脱氨活性,在配套反应体系中可以高效完整地进行单个核苷酸C到U的转化,协助进行甲基化分析。

酶法转化应用场景

酶法转化优势

TET2、T4-BGT、APOBEC是甲基化研究的工具酶,应用于NGS甲基化检测、甲基化PCR和甲基化qPCR等领域。

与传统的重亚硫酸盐法处理相比,温和的酶处理对DNA的损伤较少,能够最大程度上保持DNA的完整性,获得更好的测序质量,在FFPE DNA、cfDNA以及其他低质量或微量DNA样本的甲基化处理中,具有很大优势。

应用案例

使用ABclonal的酶原料与试剂,对100ng Human blood gDNA样本,并添加Unmethylated Lambda DNA 和 CpG-methylated pUC19两种内参,分别进行BS转化与酶法转化,然后统一采用RK20220 ABclonal Scale Methyl-DNA Lib Prep Kit for Illumina单链建库测序方式,评估甲基化转化方法的转化效率和文库质量。

数据展示:

1、TET2酶的功能验证数据

使用ABclonal TET2 原料甲基化建库,文库产量高,文库插入片段大,明显优于BS方法;

ABclonal TET2酶原料与试剂,在Unmethylated Lambda DNA内参转化率均在99%以上,在CpG methylated pUC19内参氧化效率在99%以上;

2、T4-BGT的功能验证

使用ABclonal T4-BGT 原料甲基化建库,文库产量高,文库插入片段大,明显优于BS方法;

ABclonal T4-BGT进行酶法转化构建的文库,在1% Unmethylated Lambda DNA 内参及0.1% CpG methylated pUC19 内参的转化效率均达到预期要求。

3、APOBEC的功能鉴定

ABclonal APOBEC进行酶法转化构建的文库,在建库产量,下机数据,1% Unmethylated Lambda DNA 内参的转化效率达到预期要求。

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