今天给大家剖析这篇2023.2.13发表在大子刊Cancer cell的研究论文。本文由四川大学华西医院团队完成！
本研究基于胰腺癌原发组织、肝转移组织、门静脉血循环肿瘤细胞（CTC）三种类型样本的单细胞测序。样本来源于6例具有肝转移的胰腺癌患者，且均未经过任何治疗，每个患者分别取胰腺癌原发组织、肝转移组织、CTC三种类型样本，共计18个样本。
其中同时从一个患者获取胰腺癌原发癌组织和肝转移组织相对较难，CTC获取更难（1ml血液仅含有1-50个CTC，本研究基于微流控芯片技术分选CTC），因此，本研究样本具有珍贵稀有特性。这也为本研究在临床意义上打下了较好的基础，符合目前Cancer cell大子刊接收文章的定位（偏临床、偏应用）。当然，本文的机制研究也比较出彩。
本研究提出并证实的work model为：静脉血中的CTC通过表面分子HLA-E与NK细胞表面NKG2A互作，抑制NK细胞对CTC的杀伤，促进肿瘤转移。在此选题基础上，本文继续进行机制研究，阐明了CTC如何上调HLA-E的详细分子机制。
那么提出以上work model的底层逻辑是如何逐步完成的呢？
#1. 首先，对以上18个样本的所有细胞单细胞测序结果聚类分析，可以看到CTC是一群明显不同于原发和转移灶（Epithelial）的肿瘤细胞。
#2. 接着，分析了CTC和原发/转移灶肿瘤之间差异基因，展示了最高/最低变化的30个差异基因（D），发现紫色标注的在CTC显著上调的是血小板相关基因，提示肿瘤和血小板之间可能存在相关性。并对这三类肿瘤细胞各类基因集（免疫、血小板、肿瘤发生、EMI、生物合成、凋亡、代谢和细胞周期等）的富集得分进行展示，同样包含血小板相关基因集。提示CTC和血小板聚集和激活显著相关，CTC的转移很可能和血小板相关。
#3. 为探究CTC和免疫细胞之间的互作，继续分析了三种组织样本中肿瘤细胞/CTC和各类免疫细胞之间的细胞通讯（基于受配体对）。结果表明，在原发灶和转移灶，肿瘤细胞和其他各类免疫细胞互作差别不大，但在血液中CTC和NK之间的互作通讯最为强烈，因此进一步分析NK和CTC之间的互作。
通过受配体对分析发现，CTC表面HLA-E和NK表面NKG2A相互作用，而NKG2A是NK细胞表面一种已知的免疫抑制分子，因此，可以提出猜想：CTC通过HLA-E集合NK表面NKG2A，抑制NK对CTC杀伤，导致CTC免疫逃逸，促进转移。
#4. 接着，比较了CTC和原发及转移肿瘤细胞表面HLA-E表达，发现CTC特异高表达HLA-E。
为了揭示CTC为何高表达HLA-E，本研究利用单细胞数据分别找到CTC与原位、转移肿瘤细胞之间的差异基因（DEGs）,然后计算CTC中的HLA-E表达水平和DEGs之间相关性。挑选CTC与原发/转移DEGs中最正相关的4个基因（A图）进行功能验证（B），证实RGS18可以最显著上调肿瘤细胞高表达HLA-E。据此提出猜想：CTC通过RGS18上调HLA-E，与NK细胞NKG2A互作，抑制NK效应。
#5. 接着，继续回答CTC如何获得RGS18。文献报道，RGS18主要来源于血小板，而前面第一部分数据提示CTC和血小板之间存在明显相关，另外实验肿瘤细胞可以摄取血小板（图A）。因此，提出猜想：CTC通过摄取血小板获得RGS18。并通过后续实验证实了猜想。
#6. 接着，继续探究RGS18如何上调CTC细胞HLA-E。文献报道，RGS18通过GPCR调控下游通路，本文通过Western Blot筛选了GPCR下游的一些激酶，发现RGS18过表达可以显著影响AKT通路。另有文献报道，CREB可以直接调控HLA-E表达，而且AKT可以通过GSK3β激活CREB。综合文献加实验结果，进行逻辑串联，提出科学猜想，CTC细胞中，RGS18通过AKT-GSK3β-CREB轴调控HLA-E上调。并通过后续实验进行了证实。
综合以上六方面，进行逻辑串联，本研究提出work model并进行详细机制探究，完善后的work model如下：静脉血中的CTC摄取血小板，获取血小板中的RGS18，RGS18通过AKT-GSK3β-CREB上调HLA-E与NK细胞表面NKG2A互作，抑制NK细胞对CTC的杀伤，促进肿瘤转移（如下图）。
通过以上逻辑重建，我们大概可以猜到本研究如何从课题构思到逐步设计完成work model构建。以下代表个人理解及观点，仅供参考：
-
肿瘤转移进程会进入血液，形成CTC，CTC之所以能够进行远处转移，重要原因之一是在血液中逃脱免疫杀伤。本研究聚焦于血液CTC免疫逃逸，促进肿瘤转移的细胞分子机制；
-
通过单细胞测序分析，发现血液CTC和NK细胞互作最显著，所以猜想，CTC应该通过针对NK产生免疫抑制，大致免疫逃逸；受配体对找到CTC表面HLA-E与NK细胞表面NKG2A结合；而NKG2A是导致NK免疫抑制的分子，因此以上猜想逻辑上成立；
-
于是接下来比较了CTC和原发及转移灶肿瘤细胞HLA-E表达，发现显著高表达；接着探究CTC如何上调HLA-E，通过相关性分析并验证找到RGS18；通过文献可知RGS18主要来源于血小板，加上之前有文献提示肿瘤细胞和血小板有紧密接触，考虑到膜膜融合，因此逻辑上肿瘤细胞可摄取血小板内容物，并进行了证实；
-
最后找RGS18如何上调CTC细胞HLA-E表达，此时通过反向文献研究，发现HLA-E转录可以被CREB直接调控，而AKT-GSK3β可调控CREB，接下来逻辑环路只差检测RGS18是否可以直接影响AKT通路。而文献报道RGS18通过GPCR调控下游通路，GPCR下游为激酶，其中包括AKT，因此进行排除实验，发现RGS18只能影响AKT。如此，以上形成逻辑闭环，提出并证实了RGS18通过AKT-GSK3β-CREB上调HLA-E。
-
基于以上work model的提出并建立，回头进行Figure 1数据补充，那就是，CTC与原发、转移灶肿瘤细胞相比的DEGs应该包含与血小板相关基因，而基因集富集分析中，CTC也高表达血小板相关基因集。综上，本研究从Figure1-Figure7形成逻辑闭环！