课题设计的考量角度！
本研究利用肿瘤组织单细胞测序数据寻找课题切入点并设计整个调控模式的思路非常值得借鉴。
1. 通过肿瘤组织单细胞测序数据为何要选择B细胞？
多个文献表明，B细胞在CRC肿瘤组织显著富集，但是功能呈现出异质性（抗肿瘤免疫+免疫抑制），提示CRC中很可能存在免疫抑制性B细胞亚群存在。通过单细胞测序数据也发现B细胞在CRC恶性进展中比例逐渐上升且百分比较其他类型细胞都要高，表明了研究B细胞亚群的必要性。这种研究思路告诉我们，平时文献积累的重要性，及时跟进领域前沿更有助于找到课题切入点！
2. 为何要选择B细胞中B细胞LARS亚群进行后续研究？
B细胞亚群经典分型包括三种类型（FOB：卵泡B细胞、GCB：生发中心B细胞、PC：浆细胞）；本研究单细胞数据分析表明，CRC进展中增多的B细胞亚群中出现了一个不属于三种经典分型的一种，这一B细胞亚群具有明显降低的抗体合成能力同时具有更强的TGF-β1表达为特征的免疫抑制能力，同时该亚群在CRC恶性进展中显著增加，提示该B细胞亚群极可能具有发挥免疫抑制功能促进CRC免疫逃逸。Marker基因提示该B细胞亚群以高表达LARS为特征。
3. 调控模式如何设计？
基于其它文献已证实的LARS基因功能是促进tRNA-亮氨酸参与线粒体代谢NAD生成，另有文献表明NAD可以激活SIRT1，而SIRT1也有报道可以激活PAX5，PAX5作为转录调控因子可以直接结合TGF-β1启动子区。因此本研究调控模式主要是将已报道的零散调控机制进行串联，解释了LARS如何调控B细胞免疫抑制表型。
文献精读解析如下：
今天跟大家共同学习一篇2022年6月14号，复旦大学 储以微课题组发表在Immunity上的一篇研究论文。该研究以结直肠癌小鼠模型肿瘤组织单细胞测序数据为出发点，发现一类特殊的B细胞亚群LARS高表达型B细胞亚群在进展性结直肠癌中显著富集，并证实这类B细胞可以通过分泌TGF-β导致免疫抑制，促进结直肠癌恶性进展。
题目:
LARS B细胞亚群促进结直肠癌免疫逃逸
研究背景：
结直肠癌（CRC）肿瘤中表现出增多的B细胞浸润特征，然而这些B细胞在肿瘤免疫中的作用目前报道呈现两面性。一方面，B细胞具有的抗原提呈和产生抗体作用，使得其具有抗肿瘤免疫能力，并与改善的预后相关；另一方面，多种小鼠肿瘤模型发现，肿瘤浸润的B细胞表现为免疫抑制表型，高表达免疫抑制性分子，包括PD-L1，IL-10和TGF-β。进一步解析肿瘤微环境中B细胞功能异质性及其获得免疫抑制功能的潜在分子机制将为CRC的免疫调控和治疗干预提供重要依据。
氨基酸在细胞能量代谢、氧化还原稳态维持和表观遗传调控方面发挥重要作用。已有研究发现氨基酸可以促进Treg细胞功能。然而，目前关于氨基酸与肿瘤浸润B细胞功能异质性之间的关系，尚未阐明。
本研究要解决的科学问题是：
CRC肿瘤浸润B细胞的功能异质性及其获得免疫抑制表型的潜在分子机制是什么？
研究模型：
化学诱导小鼠结直肠癌模型：AOM+DSS诱导；
研究结果：
1.进展性CRC肿瘤组织中高表达TGF-β1的LARS B细胞亚群显著富集
为了对伴随肿瘤生长的各种B细胞亚群进行分类，化学诱导小鼠CRC的模型下，作者收集中低级别和高级别上皮内瘤变（T1和T3）组织，分选肿瘤浸润CD45+细胞进行单细胞测序，并进行分析。结果显示，B细胞有九个簇，且占比较高（图1A和1B）。对B细胞和浆细胞（PC）重新分簇后，发现LARS B亚群独立于FOB、GCB和PC亚型，是一种新的功能亚群（图1C）。该LARS B细胞亚群高度表达亮氨酸tRNA合成酶2（Lars2），通路富集分析也证实亮氨酸生物合成和线粒体氨酰tRNA生物合成的显著活化（图1D-E）。此外，随着肿瘤的生长，LARS B细胞数量增加（图1F）。LARS B细胞起源于FOB细胞，并倾向于向PC分化（图1G）。LARS B类似浆细胞前体细胞，表达浆细胞驱动基因Prdm1，但抗体分泌能力较低，相反高表达抑制性分子Tgfb1，与Treg细胞通讯密切。与PC相比，LARS B细胞上调了Ptprc、Pax5、Cxcr4、Cd22、Bach2和Tgfb1，但在蛋白质加工和内质网中的基因富集度较低，而内质网与PC的抗体生成有关（图1H和S1D）。LARS B细胞与IL-10+FOXP3+Treg细胞之间存在密切的相互作用（Panduro等人，2016）（图S1A-S1C），主要取决于LARS B细胞中TGF-b1的高表达（图1I）。
2.LARS B细胞分布在肿瘤三级淋巴结构外并与CRC患者不良预后相关
小鼠CRC组织中的LARS B细胞为CD19+B220-CD20- IgD- CD138- PRDM1+ PAX5+/lo FAS- GL7-，与PC前体一致（图2A）。接下来，作者通过免疫组织化学染色观察了小鼠和人类CRC肿瘤组织中LARS B细胞的位置分布和组织特异性。与TLS中采集的大多数CD19+B细胞相比，LARS B细胞主要位于三级淋巴结构TLS外部，分散在肿瘤基质中，TLS标记物表达较低，包括Ccr7、Cxcr5和Sell（图2B-2D）。LARS B细胞定位于结肠癌组织，但在外周血、正常结肠组织中较少。同样，从大肠癌患者身上采集的大肠肿瘤、息肉和成对的非肿瘤组织显示，正常大肠组织中LARS B细胞数量较低，但在肿瘤息肉中增加，并且在肿瘤组织中含量最高（图2F）。与人类其他Breg细胞亚群相比，包括CD24+CD27+Breg细胞和CD24hi-CD38hi-Breg细胞，LARS B细胞缺乏CD24，在CD24hi-CD38hi-Breg细胞群中不存在（图2G）。此外，在小鼠结直肠癌模型和90例结直肠癌患者中，肿瘤组织中LARS B细胞的富集与结直肠癌的进展和预后相关（图2H-I）。
3.亮氨酸诱导LARS B细胞生成并促进CRC免疫逃逸
为了探索LARS B细胞的生成，作者检测了CRC浸润B细胞的各种必需氨基酸。如图3A所示，亮氨酸是B细胞消耗最多的氨基酸（图3A）。随着亮氨酸浓度的增加，亮氨酸tRNA合成酶2 LARS2增加（图3B）。TGF-b1分泌增加取决于结合亮氨酸的浓度（图3C）。LAT1抑制剂阻断亮氨酸向B细胞的转运减少了LARS B细胞的生成和TGF-b1的分泌（图3D）。构建了Lars2敲除小鼠（图3E、S3A和S3B），并分析了分离的B细胞的特性。这些结果显示，Lars2缺失的B细胞的TGF-b1分泌显著减少（图3F）。为了观察Lars2缺失的B细胞在体内的疗效，在化学诱导CRC小鼠模型中，高亮氨酸饮食使肿瘤局部产生更多的LARS B和TGF-b1，促进肿瘤进展（图3G-H）。为了进一步证实，亮氨酸可以诱导LARS B细胞生成。利用过继转移Lars2缺失的B细胞至免疫缺陷小鼠（CD79a-/-）以及在B细胞中条件性敲除Lars2（Cd79a-Cre Lars2fl/fl），发现肿瘤明显减小，并伴随着TGF-β1的分泌以及Treg的减少。
4.LARS通过影响NAD+依赖的线粒体氧化调控B细胞的免疫抑制表型
B细胞中Lars2缺失显著降低TGF-b1诱导的Treg细胞分化（图4A）。B细胞中Tgfb1的条件性缺失导致Treg细胞和CRC负荷减少（图4B-4D；表S3）。为了直接证实TGF-b1对LARS B细胞功能至关重要，从小鼠CRC肿瘤组织中纯化LARS B细胞（CD45+CD19+B220-CD138-IgD-）和其他B细胞，然后与加或不加TGF-b1的CD4+T细胞体外共培养。结果表明，LARS B细胞诱导CD4+T细胞分化为Treg细胞，这种现象可以被TGF-b1抗体抑制（图4E-4G）。这些数据表明，LARS B细胞是亮氨酸诱导的，并以TGF-b1依赖的方式参与免疫逃避。
5.NAD+依赖的SIRT1促进LARS B细胞表达TGF-β1
为了解释LARS B细胞的调节功能，作者研究了线粒体功能和能量代谢，因为LARS2位于线粒体中，负责线粒体基因翻译，包括线粒体呼吸链复合物I-V。结果表明，在Lars2缺失的B细胞中，线粒体呼吸链复合物的蛋白表达受到抑制，尤其是复合物I，NADH脱氢酶，导致NADH的NAD+再生受阻（图5A、S4A和S4B）。Lars2缺失的B细胞中NAD+/NADH比率降低，与线粒体膜电位降低一致（c）（图5B和5C）。能量代谢产物的变化和氧消耗率（OCR）证实，Lars2缺失的B细胞削弱了线粒体氧化代谢和ATP生成（图5D和5E）。通过敲降Lars2或鱼藤酮（呼吸链复合物I抑制剂）抑制B细胞中NADH的NAD+再生，可以下调TGF-b1的生成。相反，添加NAD+以剂量依赖性方式上调TGF-b1分泌（图5F）。此外，与其他B细胞簇相比，LARS B细胞富含NAD+依赖性酶，如sirtuin（SIRT）、tankyrase（TNKS）和聚ADP核糖聚合酶（PARP）（图5G）。通过小分子拮抗剂抑制这些酶（尤其是SIRT1抑制）（表S4）大大降低了LARS B细胞中TGF-b1的表达（图5H和S4C）。以上结果表明，LARS2是LARS B细胞的重要标志物，是亮氨酸增强的线粒体能量代谢，尤其是NAD+再生所必需的，依赖TGF-b1介导免疫抑制。TGF-b1在SIRT1缺陷的B细胞中的表达降低（图5I、S4I和S4J）。B细胞中Sirt1敲除小鼠的肿瘤体积较小，肿瘤结节较少。与B细胞中Sirt1敲除小鼠相比，Sirt7小鼠对CRC进展的控制较差（图5J）。在Sirt1敲除小鼠中，产生TGF-b1的B细胞和Treg细胞减少（图5K和5L）。
为了确定SIRT1的靶点，作者从WT小鼠脾脏分离出B细胞，并在体外用或不用SIRT1抑制剂（EX527）处理48小时，通过质谱获得赖氨酸乙酰化的蛋白质组学定量。作为控制B细胞发育和分化的主转录因子，作者挑选出了PAX5为SIRT1的靶点（图6A）。从动物转录因子数据库和PROMO实验室预测Tgfb1的候选转录因子，发现了5个转录因子，其中Pax5基因也在其中，且在LARS B细胞中表达。通过免疫共沉淀（CoIP）在B细胞中证实了SIRT1和PAX5之间的相互作用（图6C）。脱乙酰化PAX5比乙酰化形式更具活性，表明PAX5与Tgfb1启动子的结合增强（图6D）。此外，乙酰化肽分析确定K98是PAX5的主要乙酰化位点，该位点受SIRT1调节。K98位点的赖氨酸-精氨酸（Arg）突变产生乙酰化缺陷，降低了促进Tgfb1基因转录的能力（图6E、6F、S5C和S5D）。用siRNA干扰B细胞中PAX5基因证实了Tgfb1的PAX5转录调节（图6G、6H和S5E）。NAD+依赖的去乙酰化酶SIRT1通过去乙酰化转录因子PAX5，使其与Tgfb1启动子区的结合能力增强，促进了Tgfb1转录，是LARS B获得调节功能的重要机制。
6.亮氨酸饮食疗法可以抑制LARS B细胞介导的肿瘤免疫逃逸
最后，作者重点研究了LARS B细胞作为CRC免疫治疗靶点的潜在应用。由于LARS B细胞是亮氨酸依赖性的，作者构建了几种亮氨酸饮食方案来限制LARS B细胞介导的CRC逃避（图7A）。亮氨酸节律饮食是有效和安全的，尤其是“4+3”饮食模式（LDD-4 \/3，正常饮食4天，然后是无亮氨酸饮食3天）。在对体重和死亡率没有显著影响的情况下，“4+3”节食小鼠的LARS B细胞和肿瘤生长均被成功抑制（图7B–7D和S6D），同时TGF-b1分泌和TGF-b1介导的免疫抑制减少（图7E、S6E和S6F）。抗TGF-b1抑制了高亮氨酸饮食诱导的FOXP3+Treg细胞生成和CRC生长（图7B和7E）。4+3饮食模式在AOM加DSS诱导的CRC模型中观察到了相同的结果（图7F–7K）。为了阐明亮氨酸饮食策略的结果需要LARS B细胞，作者建立了B细胞中的Lars2条件性缺失小鼠。结果显示Lars2缺失小鼠的肿瘤负担比WT小鼠低。然而，亮氨酸饮食并没有进一步抑制Lars2缺失小鼠的肿瘤发生（图7L–7Q和S6G；表S3）。
至此，本文完成了对提出的亮氨酸通过调控线粒体NAD生成促进SIRT1激活并增加SIRT1与PAX5结合，促进PAX5结合到TGF-β1启动子区，增强TGF-β1表达导致免疫抑制这一工作模式的证明，并基于该调控机制提出了利用亮氨酸饮食疗法抑制CRC的免疫治疗方案。