美国斯坦福大学研究人员总结了单细胞和空间转录组学的发展历程和技术原理，综合阐述了单细胞和空间组整合分析方法及应用。此综述发表于2021年6月Nature Reviews Genetics上，以下为文章的详解。
文章题目：Integrating single-cell and spatial transcriptomics to elucidate intercellular tissue dynamics
发表时间：2021-06-18
发表期刊：Nature Reviews Genetics
主要研究团队：斯坦福大学研究团队等
影响因子：53.242
DOI：10.1038/s41576-021-00370-8
综述背景
单细胞RNA测序（scRNA-seq）可以识别组织内的细胞亚群，但不能捕捉它们的空间分布，也不能揭示原位作用的细胞间通讯的局部网络。近年来开发的一套在组织内定位RNA的技术，包括多重原位杂交和原位测序（这里定义为高倍数RNA成像，HPRI）以及空间条码，可以解决这个问题。然而，目前没有一种方法能像scRNA-seq那样提供完整的转录组覆盖。因此，很有必要探究将单细胞和空间数据整合的研究方法。在此，我们回顾了将scRNA-seq与空间转录组结合起来所做的努力，包括新兴的整合计算方法，并提出了有效结合当前方法学的途径。
应用范围
空间转录组学加快了阐明各种背景和器官系统中离散细胞亚群内部运作的能力。这些方法已被用于评估肝脏、肠道、骨髓、小鼠胚胎、大脑、生殖系统和心脏等健康组织的平衡和发展。在疾病研究方面，空间转录组在肿瘤微环境研究中应用最广泛；也被应用于其他疾病和损伤的微环境，如神经退行性疾病中的大脑和脊柱，心肌梗塞或其他损伤后的心脏和呼吸道感染期间的肺部。最近的工作已经开始将空间转录组学数据与其他方式（即scRNA-seq）相结合，以提供对组织组成和功能的新见解。
基本原理
整合scRNA-seq和空间转录组技术的工作流程，通过scRNA-seq数据的降维和聚类来建立细胞亚型。解卷积和映射被用来定位细胞亚群。解卷积通常应用于空间条码数据，而映射通常应用于单细胞分辨率的空间数据[即高倍RNA成像（HPRI）数据]来定位scRNA-seq亚群。评估定位亚群空间排列的算法可以进一步评估scRNA-seq数据预测的配体-受体相互作用。
高倍RNA成像（HPRI）方法通过针对特定基因的荧光探针来定位mRNA转录本。荧光探针方法通常采用一种编码方案，通过多轮杂交获得的独特的荧光探针信号序列，可以识别每个基因。挂锁探针方法通常使用针对目标基因的互补DNA（cDNA）的探针。每个探针都有一个针对每个基因的特定核苷酸的识别（ID）序列。该ID的荧光测序策略因方法而异。
空间条码法使用空间条码（ID=location barcode）poly-T寡核苷酸捕获整个组织横截面的mRNA转录物，然后进行分离和深度测序。在测序之后，每个转录本都被解复用，以根据其ID分配到其原位捕获点。
人类乳腺癌组织截面的HPRI图(图4A)，根据基因荧光信号对mRNA转录本进行解码（尚未按细胞类型进行注释，可通过制图完成）。左图：相关的苏木精和伊红（H&E）染色（比例尺=100 µm）。列出了HPRI方法的优点和缺点。对于完整的组织切片，预选的目标基因通常在100到200个之间（概念验证文献表明，在组织培养中，可达约10,000个基因，但不容易扩展到完整的组织）；一些成熟的方法，只能包括长RNA物种（大于1,000个核苷酸）。更加专业的设备通常会使工作流程更加耗费人力。
人类鳞状细胞癌横截面的空间条码图(图4B)，按细胞类型解构捕获mRNA混合物。左图：相关的H&E染色（比例尺=500µm）。列出了空间条码方法的优点和缺点，该方法具有无偏性，不涉及目标基因的选择。
整合模型
1. 整合scRNA-seq和空间转录组的流程
与任何空间转录组学方法相比，scRNA-seq通常能检测到每个细胞的独特基因数量明显增多，从而揭示出新的细胞亚型，以及每个亚群的转录组的更多细节。此外，许多scRNA-seq分析管道绘制了细胞分化的轨迹和基因调控网络。由于其深度和单细胞精度，scRNA-seq是目前定义特定组织中细胞亚群的最佳平台。
HPRI和空间条码都得益于基于scRNA-seq数据的细胞类型推断。为了更清楚地定义和验证空间数据中感兴趣的细胞类型，可以根据原位的生态位（细胞所处微环境）对细胞进行标记，然后进行测序。生态位标记的一种方法是使用光活化报告器，它被特定波长的光激活以标记特定的组织生态位。
鉴于mRNA是蛋白质表达的代表，基于scRNA-seq的HPRI数据的细胞类型分配的一个有价值的手段，是使用免疫荧光显微镜或成像质量细胞术进行基于表位的多重组织成像。免疫荧光显微镜揭示了更详细的细胞器结构，而成像质谱仪通常绘制更多的蛋白质目标，这两种方法都需要有效的抗体试剂。新兴的综合方法包括一种同时测量mRNA转录物和16种不同蛋白质的成像质谱仪方法。这些方法为组织中的空间转录组学数据提供了宝贵的蛋白质层面的佐证。
2. 解卷积和映射方法
整合单细胞和空间转录组学数据来定位细胞亚型的计算方法。由于空间转录组学与scRNA-seq相比，只能测量一部分基因，所以基于scRNA-seq的细胞类型的解卷积和映射，可以丰富空间转录组学细胞类型组织图。
对于空间条码数据，可以通过解卷积每个捕获点的mRNA转录物的混合物，来预测每个点的细胞混合物中每种细胞类型的比例来定位细胞亚群。
对于HPRI数据，可以通过将scRNA-seq获得的细胞类型映射到每个空间分辨率的细胞上来定位细胞亚群。使用scRNA-seq细胞亚型来表征空间转录组学数据的解卷积和映射方法存在一个加权光谱，理论上，每一种类型的方法都可以应用于阐明捕获点和单细胞转录物混合物的亚型组成。统计回归最常被应用于捕获点的解卷积，而基于聚类的映射方法大多用于HPRI细胞类型的映射。
3. 解卷积和映射判断细胞类型基本原理
基于回归的解卷积法将按细胞类型聚类的scRNA-seq数据与捕获点数据结合起来，产生一个包含捕获点概况与scRNA-seq细胞亚型重叠的矩阵。回归法被用来寻找最能解释每个捕获点混合物的scRNA-seq亚型信息。
有两种主要的方法来处理解卷积：推断一个给定点的细胞亚型的比例和对一个给定的空间转录组学点与单一细胞亚型的对应程度进行评分。有许多模型可以从整个组织样本的mRNA混合物中分解出细胞类型，如从bulk RNA-seq；然而，鉴于空间条码方法最近才作为一种可获得的技术出现，数量有限的模型是专门针对从捕获点分解mRNA混合物的。无论采取哪种方法，解卷积的第一步是确定特定组织样本中存在哪些细胞亚型。
基于推断的去卷积技术涉及估算每个细胞类型在一个给定的捕获点中的比例。这种形式的去卷积的方法之一是采用基于统计回归的模型，它使用包含每个细胞的细胞分类信息的scRNA-seq数据矩阵来去卷积每个捕获点的mRNA混合物。多种线性回归模型已被应用于解卷bulk RNA-seq混合数据，非负最小二乘法和阻尼加权最小二乘的线性回归已被专门应用于捕获点混合物的解聚。
像解卷积一样，映射的第一步是根据scRNA-seq数据确定细胞亚型。映射的主要挑战是将基于scRNA-seq的细胞类型分配给HPRI数据中的每个细胞：基于scRNA-seq的细胞类型评分可以应用于HPRI的每个细胞，类似于应用于捕获点的评分。早期对scRNA-seq数据进行空间映射的研究是依靠对少数标志性基因的ISH来将scRNA-seq细胞概率地映射到用户定义的区域、2D或3D空间的单细胞坐标。然而，这些方法依赖于组织有一个原型结构。此外，鉴于HPRI技术的快速发展，大多数映射算法还没有发展到专门解决scRNA-seq与HPRI的整合，相反，它们把重点放在批量校正两个不同的scRNA-seq实验上，并成功应用于单细胞分辨率空间数据。
4. 细胞亚群的配体和受体的表达研究
在一个特定的组织生态环境中，如果细胞亚群在空间上相互接近（图8A），并在信号接收细胞中表现出适当的靶基因特征（图8B），那么它们就更有可能进行交流。通过评估与特定捕获点的共定位和/或相邻捕获点或细胞中的细胞类型的表达，来确定沟通的细胞类型。
SpaOTsc算法通过配体-受体靶基因共表达，来预测给定配体-受体对的最大交流范围。基于配体-受体和配体-受体-靶基因共表达的约束关系，scRNA-seq数据可以单独建立细胞间的通讯，空间信息可以用于预测最大通讯范围来加强这种分析，如果配对之间的距离比文献中记录的典型范围预期的要远得多，则可以否定通讯。
细胞亚群之间的相互作用促成了组织的平衡、发展和疾病。鉴于许多细胞通讯，特别是近分泌和旁分泌通讯（juxtracrine and paracrine communication），是受空间限制的，空间转录组学数据很适合评估从scRNA-seq计算出的配体-受体相互作用的可靠性。预测细胞间通讯的配体-受体相互作用的标准算法主要包括scRNA-seq数据和已知配体-受体相互作用的数据库。对于一个已知的感兴趣的对象，如肿瘤研究前沿，配体和受体在该区域的近端点的共同表达可以被评估是否统计学上高于背景，从而有可能将洞察力从细胞分型扩展到驱动表型变化的蛋白质互作水平的细胞通讯研究。
总结
这篇综述提供了较为全面的单细胞与空间组学的基础知识，并清晰总结了单细胞与空间转录组综合分析的方法、原理和应用场景，提供了较为完整的知识体系，非常适合作为入门材料。