标题：Single-cell RNA sequencing demonstrates the molecular and cellular reprogramming of metastatic lung adenocarcinoma
期刊：Nature communications（IF=14.919）
导读
非小细胞肺癌(NSCLC)在组织学上分为腺癌、鳞状细胞癌和大细胞癌。肺腺癌(LUAD)是最常见的类型，约占所有肺癌的40%。LUAD常见转移部位在脑、骨骼和呼吸系统中，常在转移期检测到。远处转移是肺癌死亡的主要原因;然而，转移性肺癌的具体方面及其相关的微环境仍然知之甚少。本研究提出了转移性肺腺癌的单细胞转录组谱。从44名患者的208,506个正常组织或早期、转移期癌症细胞中，我们确定了一种偏离正常分化轨迹并主导转移期的癌细胞亚型。另外发现随着T细胞衰竭，正常的骨髓细胞群逐渐被单核细胞来源的巨噬细胞和树突状细胞所取代。这种广泛的单细胞分析增强了我们对转移性肺癌分子和细胞动力学的理解，并揭示了癌症微环境相互作用中潜在的诊断和治疗靶点。
结论
▶ 早期、晚期和转移性LUAD的细胞动力学
从44例未治疗LUAD患者的支气管超声/支气管镜活检或手术切除过程中获得了原发肺组织、胸膜液、淋巴结或脑转移瘤组织(图1a)。同时收集远端正常组织或淋巴结进行对比分析。将208,506个细胞分类为9个不同的细胞谱系，包括上皮细胞、基质细胞（成纤维细胞和内皮细胞）、免疫细胞（T、NK、B、髓系和肥大细胞），以及在脑中特有的少突胶质细胞（图1）。研究发现，与正常肺组织(nLung)相比，早期和晚期肺癌(tLung和tL/B)中T和B淋巴细胞富集，自然杀伤细胞(NK)和髓系细胞下降。另外与正常淋巴结(nLN)不同，转移淋巴结(mLN)含有大量的骨髓细胞。
▶ 与LUAD进展相关的肿瘤内在特征
为了找到与LUAD肿瘤进展或转移相关的基因，本研究使用肿瘤细胞和正常上皮细分的细胞进行拟时序分析，共分为3个时期，其中肿瘤细胞形成了一个分支结构，沿正常上皮细胞有两种转录状态(tS1和tS3);然而，一个(tS2)被观察到明显定位于tS1和tS3分支的相反两端（图2a,b）。大多数与S1-和S3相关的基因与维持表面活性物质稳态、肺泡发育和纤毛运动的正常上皮功能有关（图2c）。相反，S2相关基因表现出明确的肿瘤导向特征，如侵袭性细胞运动和异常增殖或凋亡。因此，tS1和tS3状态代表正常分化程序的去调控，而tS2肿瘤细胞状态完全偏离了正常的转录程序。研究发现LUAD患者同时存在tS1和tS2肿瘤亚群，但 tS3较少（图2d）。从晚期活检或转移灶(tL/B、mLN和mBrain)分离的肿瘤细胞中tS2特异性基因表达增加，提示其与肿瘤进展和转移有关（图2e）。通过免疫组化也验证了这一发现，并且在临床中发现，tS2基因高表达的患者总生存期较差（图2f-g）。
▶ 基质细胞协调组织重塑和血管生成
对6268个基质细胞进行研究，其中2107个为内皮细胞，3794个为内皮细胞。内皮细胞经过聚类被分为了8个细胞亚群（图3a）。大多数EC细胞簇属于正常组织，并划分为已知的血管细胞类型，包括尖端和茎样细胞，淋巴EC细胞和内皮祖细胞（图3b）。相比之下，在tLung和mBrain样本中，发现了一个特异的细胞簇——肿瘤衍生的ECs (EC-C1)（图3c）。另外通过肿瘤ECs的基因表达网络分析发现血管生成这一基因功能表达上调，可能是脑转移瘤和原发肿瘤诱导类似的血管改变以适应广泛的新生血管形成（图3d）。同时，肿瘤ECs中显著下调的基因与免疫激活相关(图3d)，这与前人研究一致，肿瘤ECs抑制免疫应答。
成纤维细胞被聚类为12个不同的簇，分为7种已知的细胞类型（图3e）。COL13A1+和COL14A1+基质成纤维细胞是正常肺组织和早期肿瘤组织的主要成纤维细胞类型。FB-C3中的肌纤维母细胞仅来源于肿瘤组织，包括tLung、tL/B和mLN样本。肌成纤维细胞被认为是与癌症相关的成纤维细胞，能促进广泛的组织重塑、血管生成和肿瘤进展（图3f-g）。
▶ 髓系细胞介导的抑制性免疫微环境
42245个髓系细胞被聚类为15个细胞亚群，主要分为单核、巨噬、DC细胞，其中中性粒细胞未被检测到（图4a、b）。接下来， 对DC细胞进行细分，主要分为7个细胞亚群，并展示了每种DC亚群的marker基因表达（图4d、e），这使得髓系细胞中DC细胞得以更加细化（图4f）。研究发现，pDC细胞在正常肺组织很少，但在某些肿瘤组织和转移淋巴结中增加（图4g-h）。
▶ 肺癌进展中的B细胞和T/NK细胞介导的免疫反应
27657个B细胞被聚类为14个簇，被定义为6中细胞类型（图5a）。follicular B在各个组织中都特异性富集（图5b）。其次，我们在原发性肿瘤和淋巴结转移中分别发现了比正常肺和淋巴结更多的GC B细胞，这表明在一些LUAD患者中，体液免疫反应高度激活。64403个T/NK细胞被聚类为20个细胞亚群，被定义为幼稚CD8+T、Treg、CD4+Th、NK细胞等10种细胞类型（图5c）。研究发现，与正常组织相比，原发肿瘤组织中NK细胞减少，调节性T细胞(treg)增加（图5d）。Treg细胞持续存在于tL/B、mLN和mBrain中，在肿瘤进展和转移过程中发挥抗肿瘤免疫的抑制作用。图5e-f 展示了CD8+T细胞中naïve、细胞毒性或耗竭状态下的动态功能谱。其中细胞毒性CD8+T细胞主要存在于正常肺组织，耗竭CD8+ T细胞主要来源于肿瘤组织，幼稚CD8+T细胞主要存在于nLN，PE样本中。总之，T细胞的细胞组成和基因表达表型的改变证实了LUAD中肿瘤免疫向免疫抑制的方向发展。
▶ LUAD进展和转移期间的表型改变
通过对40个免疫细胞和基质细胞亚群的不同组织分布进行卡方检验，进一步证实了LUAD进展期间的细胞动力学（图6a）。发现肿瘤特异性亚群，包括pDCs、肌纤维细胞、肿瘤-ECS，Tregs等细胞在早期或者转移样本中发现，而来源特异性免疫细胞和基质细胞亚群(肺泡mac、胸膜mac、小胶质细胞/mac和FB样细胞)则与相应的组织部位特异性相关。耗竭CD8+ T细胞和mo-Mas在LUAD进展和转移过程中显著增加（图6b）。此外，肿瘤微环境中这两个亚群的增加与肿瘤突变负荷 (TMB)相关（图6c）。为了描述潜在的细胞间关系的分子联系，构建了一个使用潜在受体-配体对相互作用的细胞通信网络。在tLung中，我们证实了tS2与髓系或基质细胞类型之间的显性交流（图6d）。在网络中，tS2细胞和mo- mac细胞之间的相互作用被预测为最显著的，而mo- mac细胞和耗竭的CD8+ T细胞之间的相互作用被观察到是免疫细胞网络中最显著的。mo- mac和耗竭的CD8+ T细胞的比例也与tS2癌细胞的增加呈正相关(图6e)。
参考文献：