文章题目：Identification of HSC/MPP expansion units in fetal liver by single-cell spatiotemporal transcriptomics
期刊：Cell Research（IF=25.617）
发表时间：2021年8月
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科学问题
在哺乳动物中，造血干细胞和多能祖细胞(HSC/MPPs)处于造血系统的顶端，具有多血统分化和自我更新能力，明确HSC/MPPs的分化机制将为再生医学带来巨大希望。目前通过遗传操作或优化培养条件实现长期的体外HSC/MPPs扩增已经有较多研究，然而在体外扩增培养中，如何保持HSC/MPPs的细胞干性，仍是一大难题，因此，全面了解HSC/MPPs在其体内固有生态位的增殖分化机制具有重要作用。
实验技术
10X genomics scRNA-seq, 10x Visium，Stereo-seq
主要结论
本研究通过构建小鼠胎肝(fetal liver, FL)的时空转录组图谱，发现了三个异质性的HSC/MPPs亚群，其中高表达Cd93的亚群显示出增强的干细胞特性。此外，通过单细胞转录组（scRNA-seq）和空间转录组（ST）的联合分析，发现了新的HSC/MPP “口袋样” 单元(HSC plus)，由FL 生态位细胞(肝母细胞、基质细胞、内皮细胞和巨噬细胞)组成，巨噬细胞在其中显著富集，在HSC/MPP扩增中起支持作用。最后，跨物种分析和功能验证表明，小鼠和人类的FL HSC/MPPs之间的细胞-细胞相互作用和扩增机制是保守的，但转录图谱存在差异。这些结果将为体外扩展人类HSC/MPPs功能提供重要指导。
实验结果
⚫ 小鼠胎肝的单细胞转录组图谱
已有研究表明，FL HSC/MPPs在E11.5至E14.5之间表现出明显的扩增和分化特征。为了研究HSC/MPPs及其生态位的时间动态变化图谱，研究者选取E11.5至E14.5的小鼠胎肝，通过FACS分选了HCs（hematopoietic cells，造血细胞）、ECs（endothelial cells，内皮细胞）和非造血/非内皮细胞，按一定比例混合后进行单细胞转录组测序。经过数据质控和过滤后，共剩余32,449个单细胞用于聚类分析(图1b)。根据marker基因，共注释21个细胞簇(图1c)，包括18个HCs簇和3个结构生态位细胞簇，且细胞比例与发育阶段呈动态相关。随后研究者对其中四个发育阶段（E11.5, E12.5, E13.5, E14.5）的细胞进行DEG (differentially expressed genes, 差异基因)和GO分析，进一步了解了在FL发育过程中HSC/MPPs和结构生态位细胞组成的动态变化、细胞类型特异性基因表达和阶段特异性生物学功能。
⚫ 富含Cd93的HSC/MPPs表现出增强的干细胞特性
为了进一步分析HSC/MPPs的转录组特征，研究者选择HSC/MPP1-3簇，探究它们之间的潜在差异。DEG和GO分析发现，HSC/MPP1中高表达Mycn、Mecom和Hlf；HSC/MPP2中，代谢和谱系特异性基因高表达;而在HSC/MPP3中，细胞周期相关基因高度富集(图2b, c)。为了进一步评估异质HSC/MPPs的干细胞特性，研究者通过计算hscScore评估了各亚群的干细胞特性，并结合PHATE轨迹分析，发现HSC/MPP1占据了造血系统层次的顶端(图2e)，表现出最强的干细胞特征。
基因Cd93在HSC/MPP1中的表达明显高于HSC/MPP2-3 (图2f)，且已被证明在造血祖细胞中表达，因此研究者将Cd93和其他HSC/MPP谱系标记（Lineage– Sca-1+c-Kit+(LSK), Flt3– LSK, CD150+CD48– LSK (SLAM-LSK））结合，将HSC/MPP进一步细分为 Cd93+和Cd93-两组。且Cd93+细胞(Cd93+LSK、Cd93+Flt3-LSK和Cd93+SLAM-LSK)比Cd93-细胞具有更高的集落形成能力，重构和自我更新能力(图2g-j)；而在敲除Cd93的胚胎中，HSC/MPPs的比例明显下降。综上所述，Cd93不仅是表征HSC/MPP异质性的表面标记物，而且是FL HSC/MPPs发育所必需的。
⚫ scRNA-seq和ST整合分析解析HSC/MPPs和FL生态位细胞之间的相互作用
研究者使用CellPhoneDB构建了HSC/MPPs和FL生态位细胞之间的相互作用网络，分析发现，除已知的配体-受体对，还发现了一些未被识别的配体-受体相互作用，与细胞生长，细胞因子，Notch信号通路相关(图3b, c)。
为确定所预测的相互作用是否确实存在于解剖组织中，研究者选取E14.5胚胎的四个切片进行了空间转录组测序，共有3,791个spot用于FL区域的单细胞和空间转录组联合分析。并通过经典marker基因的区域性表达，评估ST在解析空间组织中的表现。
⚫ 鉴定HSC/MPPs的扩展单元
为了确定细胞-细胞间相互作用的结构基础，研究者将HSC/MPP定位的spot定义为点内点 (表示最近的关系)，HSC/MPP周围的spot定义为点间点 (表示第二近的关系)，以及其他距离较远的spot为others(表示几乎没有交互关系)(图4a)，通过分析不同细胞类型的spot富集得分来表征细胞之间的空间距离。结果显示EC细胞内spot的富集得分最高，接近于HSC/MPPs; 在点内和点间的巨噬细胞得分高于其他远点的巨噬细胞，被认为是一种新的空间上接近HSC/MPPs的生态位细胞(图4b)。
同时为了定量地比较HSC/MPPs与不同生态位细胞之间的相互作用，研究者新定义了一个概念：富集指数，即每种细胞spot的富集得分中位数与所有spot的富集得分中位数的比值。结果显示巨噬细胞在点内富集11.52倍，点间富集1.31倍，远高于EC，肝母细胞和基质细胞 (图4c, d)。此外，研究者使用Stero-seq技术，进一步验证了以上结果，即巨噬细胞是与HSC/MPPs关系最密切的生态位细胞。
随后，研究者进一步分析了CellPhoneDB预测的交互信号的空间表达，发现编码配体的基因在点内和点间的生态位细胞中高表达(图4e-i)，而受体相关的基因富集于HSC/MPPs定位点(图4e-i), 表明空间邻近性便于信号交互作用，从而进一步促进HSC/MPP扩展。鉴于点内和点间细胞间具有空间近端关系和丰富的交互信号，研究者将其定义为扩展单元，位于核心的HSC/MPPs与周围的生态位细胞相互作用(图4f, h, i)。
⚫ FL生态位细胞在促进HSC/MPPs扩张中的功能验证
为了阐明巨噬细胞如何调节HSC/MPP的扩张，研究者使用免疫荧光检测技术，发现E14.5阶段HSC/MPPs和巨噬细胞之间存在两种空间模式，一种是HSC/MPPs附着在近端巨噬细胞上，另一种是HSC/MPPs被巨噬细胞包围(图5a-d)，表明巨噬细胞可能通过形成“口袋状”结构来促进HSC/MPPs的扩张。将E14.5 HSC/MPPs与巨噬细胞及富含巨噬细胞分泌物MDK的培养基共培养，结果显示巨噬细胞可以通过分泌MDK因子促进HSC/MPP的扩张(图5e-g)；巨噬细胞耗尽后，FL细胞的绝对数量和HSC/MPPs的比例下降(图5h-l)。通过进一步的生物信息分析、免疫荧光成像和共培养试验，发现Mac1和Mac2分别来源于HSC/MPPs和EMPs（erythro-myeloid progenitors，红细胞-髓系祖细胞），均在HSC/MPP扩张中发挥重要作用。
⚫小鼠和人类造血功能的跨物种分析
为了分析小鼠和人类之间FL造血功能的保守性和差异，研究者将本研究的scRNA-seq数据与最近发表的人类FL的scRNA-seq图谱进行了比较。分析发现两个物种的FL细胞类型和HSC/MPP系(红细胞/髓细胞/淋巴细胞)分化途径高度相似(图6b)，且存在多个相同的典型HSC/MPP marker基因。但尽管总体上相似，两者也存在对外部刺激的物种特异性适应性反应。
参考文献
[1] Gao Suwei, Shi Qiang, Zhang Yifan et al. Identification of HSC/MPP expansion units in fetal liver by single-cell spatiotemporal transcriptomics.[J] .Cell Res, 2022, 32: 38-53.