原文名称：Characterization of the heterogeneity of endothelial cells in bleomycin‑induced lung fibrosis using single‑cell RNA sequencing
期刊：Angiogenesis（IF=9.596）
导读
特发性肺纤维化(IPF)会造成正常肺泡毛细血管缺失和血管生成失调;然而，特异性内皮亚群在肺纤维化发展中的作用尚不清楚。本研究通过单细胞RNA测序来表征博莱霉素(BLM)诱导大鼠肺纤维化过程中内皮细胞(ECs)的异质性。其中，ECs的一个亚群以Nos3和C的表达为特征，主要分布在非纤维化肺中，也高度表达与机械刺激反应和肺/心脏形态发生过程相关的基因。在BLM处理的肺中，以Cxcl12为特征的另一个ECs亚群被观察到与转录组数据中的促纤维化过程密切相关，如血管生成、胶原结合和趋化因子活性的调节。利用CellPhoneDB软件，我们生成了一个复杂的细胞-细胞相互作用网络，该网络预测了EC亚群在招募单核细胞、诱导成纤维细胞增殖以及促进细胞外基质(ECM)的产生和重塑方面的潜在作用。综上所述，我们的数据显示了纤维化肺中内皮细胞的高度异质性，并提出内皮细胞、巨噬细胞和基质细胞之间的相互作用可能引起病理性IPF。
结果
1. BLM处理和对照大鼠肺的单细胞图谱
在BLM处理的大鼠第28天观察到明显的肺纤维化和血管生成。从3个BLM处理的大鼠(第28天)和3个对照大鼠肺中生成单细胞悬液。使用BD Rhapsody系统对样本进行ScRNA-seq检测(图1A)。25547个细胞通过无监督聚类为25簇，并进行了定义。发现，每种细胞类型在对照组和BLM处理的肺样本中都有，但比例不同，尤其是内皮细胞（ECs）、基质细胞和巨噬细胞（图1B）。
2. ECs的转录组异质性
为了进一步确定内皮细胞(Cluster 3)在纤维化肺中的详细作用，对内皮细胞进行了亚群细分，确定了五个不同的亚型/亚群，并且列出了每群细胞的top3的marker基因（图2A,B,C）。维恩图显示，a、b和c类ECs尽管在t-SNE中存在空间上的密切关系，但在转录组中是不同的(图2D)。与对照肺样本相比，BLM处理的肺中a、b和c簇ECs的数量和比例增加，而d类ECs减少(图2E)。
3. 内皮细胞潜在的功能异质性
对内皮细胞的亚群进行了GO和KEGG富集。Cluster a ECs富集了细胞趋化性、VEGF生成、血管生成调节、ECM结合过程以及VEGF、toll样受体和tgf – β信号通路；，在cluster b ECs中，细胞粘附、对皮质类固醇的反应和上皮细胞迁移过程的调节增加，并增加ErbB信号通路; Cluster c ECs在癌症中富集，用于萌发血管生成和上皮管形态形成过程和途径; Cluster e ECs富集卵泡刺激素分泌(FSHS)、促性腺激素分泌和细胞对瘦素刺激过程的反应; Cluster d ECs在机械刺激/细胞对机械刺激的反应、肺/心脏形态发生、血管重塑和心室发育过程中富集，显示了内皮细胞不同亚群的功能异质性（图3）。
4.巨噬细胞和基质细胞的单细胞图谱
对巨噬细胞和基质细胞进一步细分，分别被分为5个细胞亚群（图4 A,E）。其中巨噬细胞Cluster（1，2，3，4）被定义为Ear2 high-Ams，Cluster 5被注释为间质巨噬细胞(IMs)。每群细胞特异性表达的基因不同，富集到的功能也不同（图4A,B,C,D）。基质细胞Cluster 3被定义为肌成纤维细胞,高表达Acta2, Actg2和Myh11。Cluster 5表达高水平的血管生成相关基因（图4 F,G,H）。
5.由CellPhoneDB预测细胞间通讯
接下来使用CellphoneDB，系统地研究了ECs、巨噬细胞和基质细胞之间的相互作用。发现，对照组和BLM治疗组肺的常见配体受体对均为TGFB3_TGFBR3、NRP1_VEGFA、AXL_GAS6和COL4A5_a1b1复合物。在BLM处理的肺中，增加的配体受体对是CD44_HBEGF、VEGFA_FLT1和VEGFA_KDR（图5A）。相互作用网络分析表明，内皮细胞、巨噬细胞和基质细胞之间可能存在相互作用（图5B,C）。BLM处理的肺中CXCL12_CXCR4 (ECa_ M1)、COL1A1_a11b1 (ECa_F5)、COL4A1_a1b1复合物(ECa_F4)、FGFR1_FGF9 (ECa_F3)和VEGFD_FLT4 (ECe_ECa)的富集证明了a类 ECs在招募循环单核细胞、诱导成纤维细胞增殖和促进ECM产生方面的潜在作用（图5D）。TNFSF9_IL13RA2 (M3_ECd)、FZD6_WNT4 (ECd_F2)、SELP_CD34 (ECd_F1)和FLT1_VEGFB (ECa_M5)的富集提示d类ECs与正常肺的生物学过程密切相关(图5E)。
参考文献：