期刊：Nature Communications （IF：14.919）
技术：scRNA-seq
导读
T大颗粒淋巴细胞白血病（T-LGLL）是一种对免疫抑制疗法有反应的淋巴增生性疾病和骨髓衰竭综合症。本文对13名患者的CD3+T细胞（在阿仑单抗治疗前后取样）进行了单细胞TCR和RNA测序分析。效应记忆T细胞和TCR多样性的丧失在T-LGLL中普遍存在的。不存在共有的TCRA和TCRB克隆型。细胞存活和凋亡基因程序的失调，以及CD8+克隆中凋亡基因的明显下调，是T-LGLL细胞的突出特征。通过阿仑单抗治疗后凋亡基因有所上调，在应答者中比非应答者上调更多。凋亡基因的基线表达水平可以预测血液学反应。阿仑珠单抗不会减弱TCR的克隆度，并且经过治疗后TCR的多样性会进一步倾斜。通过对单细胞数据分析进行推论有助于理解T-LGLL中克隆扩增和持续存在的病理生理机制。
结果
1.对T-LGLL病人的T细胞进行scRNA-seq显示了CD8+效应T细胞的扩增
构建13名患者CD3+T细胞的图谱，并对数据进行校正。通过CD4+和CD8+T细胞特征基因的表达来进一步验证细胞注释和样本混合。CD4+和CD8+T细胞被认为是CD3+ T富集细胞群的主要组成部分。在治疗之前，患者的CD8+亚群范围为32.6-87.5%，并且T-LGLL患者中CD8+亚群比例普遍升高。通过对cluster进行注释来识别初始、中央记忆型以及效应T细胞。患者中的亚群组成各不相同，但效应记忆T细胞在患者中更普遍。
2.T-LGLL患者中TCR库多样性的丧失
前三个扩增的TCR克隆占患者测序CD3+T总数的70%，但病例之间存在差异。在目前的研究中，scTCR-seq在鉴定top克隆方面与流式细胞术和CDR3测序的相同病例的结果一致，但分辨率更高。通过绘制每个V和J基因匹配的细胞数量显示患者表现出的克隆扩增。与健康供者相比，患者样本中TCR的基尼指数明显更高。通过计算香农熵(H)指数来评估每个样本TCR库的多样性，患者明显低于健康供者。CDR3的异常尺寸分布和克隆尺寸的更大规模幂律分布也证明了TCR库多样性的丧失。
3.TCR的使用和激活状态与T细胞表型有关
综合所有个体和时间点的数据，使用扩散图来对T细胞表型变异进行可视化分析，并强调与T细胞激活和T细胞终端分化相关的成分的表达，以便使用回归分析来检验它们对T细胞表型的影响。T细胞激活是在维度1上提供最多信息的组成部分，并且存在一个可以连续改变T细胞活化的模式。T细胞的末端分化、促炎和溶细胞效应相关通路，与T细胞激活在维度1上的作用方向相同，这可能是由于每个通路中有中度重叠的基因，或者相关功能基因的协调导致。当用颜色表示CD8+T细胞中T细胞亚群特征基因时，分化轨迹从初始T细胞到中枢和效应记忆T细胞。通过相关性分析，TCR表达导致22%的T细胞表型变异，在扩散图中显示维度2下TCR表达连续增加。这些结果表明T细胞表型是由抗原TCR刺激和环境刺激的组合引起的。在具有扩展和非扩展克隆的颜色编码的同一扩散图上，扩展的克隆聚集在维度1的左侧，表明T-LGLL中克隆扩展对转录组的影响。在患者和健康供体中，TCR多样性与T细胞活化之间存在正相关关系，但与TCR的表达没有正相关关系。综上所述，T-LGLL中的CTL扩增与TCR多样性降低和T细胞活化增加有关。
4.T-LGLL中细胞存活和凋亡基因程序的异常
利用GSEA来探索T-LGLL的变化，发现患者上调的基因在免疫应答和有关细胞存活的信号通路和细胞增殖中高度富集，而T-LGLL中表达较低的基因在细胞凋亡途径中富集。使用RT-qPCR在患者中测量了JAK-STAT途径中84个基因的表达，这些基因在T-LGLL患者中被激活，并且scRNA-seq和qPCR的结果显示出良好的相关性。尽管Fas和FasL在患者中过表达，但细胞凋亡基因包括TNF、CASP10和ATM下调，抗凋亡基因上调。使用STRING数据将顶级差异表达的基因映射到蛋白质-蛋白质相互作用网络，识别具有生物学意义的基因子网。其中CD8A是最独特的中心基因，表明了细胞毒性T细胞的激活和免疫反应。
参考文献：