标题：Single cell transcriptomic landscape of diabetic foot ulcers
期刊：Nature Communications（IF=17.694）
导读
糖尿病足溃疡(DFU)是糖尿病的一种严重并发症，其发病机制尚不完全清楚。在本研究中，使用单细胞RNA测序技术对来自于患者的足部、前臂和外周血的174,962个单个核细胞进行了分析；分析发现，在创伤愈合的DFU患者中，一个独特的过表达MMP1、MMP3、MMP11、HIF1A、CHI3L1和TNFAIP6的成纤维细胞群体富集，M1巨噬细胞极化增加。此外，空间转录组学分析表明，与伤口边缘或未损伤的皮肤相比，这些愈合相关的成纤维细胞更倾向于定位在伤口床。同时空间转录组学也证实了M1巨噬细胞和M2巨噬细胞分别在治疗者和非治疗者中有较高的丰度。该研究为伤口愈合微环境提供了深入的见解，确定了促进DFU愈合的关键细胞类型，并可能为DFU治疗的新治疗方法提供信息。
主要内容
1. DFU愈合与成纤维细胞亚群显著相关
为了研究DUF愈合相关的因素，本研究对17名糖尿病患者（11例有DUF，6例无DUF），10例健康非糖尿病受试者的 DUF，足部，前臂的皮肤组织和血液进行采样并进行单细胞测序研究（图1a）。共检测了174962个细胞（94325个细胞来自于足部，37128个来自于前臂，43455来自于血液），聚类为37个细胞群，通过marker注释为了21个细胞类型（图1b、c）。接下来比较了不同组之间细胞类型的组成丰度，发现成纤维细胞的转录组图谱存在显著的异质性，并确定了一个独特的成纤维细胞群体—愈合富集成纤维细胞-HE-Fibro，该群体在DFU-Healers的样本中丰度明显较高。
2.不同部位中单细胞转录图谱的异质性
为了比较不同部位的细胞特异性，对足部、前臂和血液的细胞组成进行了比较，发现不同组织部位细胞的组成有较大差异（图2a,b）。足部标本中纤维母细胞、平滑肌细胞、黑色素细胞、汗腺细胞、血管内皮细胞和淋巴内皮细胞富集。对角质形成细胞的分析显示，基底和分化的角质形成细胞分别在足和前臂样本中占优势；而免疫细胞主要在PBMC样本中占优势。为了更深入地研究足部和前臂间差异丰度细胞(即成纤维细胞和角质形成细胞)的基因表达情况，对它们的转录组谱进行了比较分析（图2c-f）,列出了其差异基因以及富集到的相关的功能。
3.不同临床样本组的转录图谱
为了更好的理解DUF在系统层面的影响，该研究单独分析了四个临床组的PBMC样本，分别是健康组(没有糖尿病的健康受试者)、DFU- healer(有治愈性DFUs的糖尿病患者)、DFU- non- healer(未治愈的糖尿病患者)和糖尿病组(没有DFU的糖尿病患者)（图3a）。通过比较发现DFU- healer中有更高比例的naive 和早期的T淋巴细胞，其表达CCR7，表明其对于激活其他的T细胞亚群具有重要的作用（图3b）。对T淋巴细胞、CD8T2和NKT细胞的进一步DEGs分析表明，在DFU- healer中过表达T细胞特异性基因，如IL7R、TCF7和CCR7，而DFU- non- healer过表达NKT谱系基因，如NKG7、GNLY、CCL5和KLRD1。对这些T/ NKT细胞的通路分析表明，与DFU-Non-healers相比，DFU-Healers在系统水平上抑制了关键的免疫和炎症通路，包括IL-6、IL-8、T辅助细胞中的CD28信号通路、ico – icosl通路以及RhoGDI和EIF2信号通路的激活。
4.足溃疡细胞分析揭示局部炎症对糖尿病创面愈合的意义
为了绘制DFUs位点的转录组和细胞图谱，我们对26个足细胞样本中的94,325个细胞进行了集中分析，并分组进行展示（图4a）。与DFU- non- healer、糖尿病患者和健康对照相比，DFU-Healers组He – fiber细胞数量显著增加（图4b）；与DFU- non- healer组相比，DFU-Healer组M1巨噬细胞(促进炎症的经典激活巨噬细胞)的比例也显著高于M2巨噬细胞(具有抗炎特性的替代性激活巨噬细胞)（图4c）；此外，一组过表达增殖标记物CENPF、PTTG1、MKI67和TOP2A的SMCs, SMC2在DFU-Healers中显著富集(图4d，e)突出表明在愈合的DFUs中存在高度增殖的SMC簇。接下来比较了不同组间的差异基因和功能富集，发现在DFU-Healers中已知的炎症反应调节因子IL17信号通路被激活，同时展示了在DFU-Healers中激活的上游调控因子，包括HIF1A, TNF等。
5.愈合相关的成纤维细胞通过促进基质重塑和炎症反应来驱动DFU愈合
为了进一步描述成纤维细胞在伤口愈合中的作用，对产生14个亚簇的成纤维细胞进行了重点分析，这些亚簇代表成纤维细胞的不同分子状态或亚型。对每个cluster 的细胞的表达谱进行了分析，发现其具有较大的异质性，并发现cluster3中显著富集了表达ECM重构相关基因的细胞，包括MMP1和MMP3。Cluster 4表现为过表达POSTN和ASPN，与ECM信号、粘附和迁移有关。基于对每个cluster 的关键基因的研究发现了愈合相关的成纤维细胞标志，包括ECM重塑和炎症反应相关基因:MMP1、MMP3、IL6、CHI3L1、ASPN、POSTN和PLA2G2A。研究推测CHIL3L1是通过表达促炎和ECM基因共同改善创面修复而驱动he – fiber愈合表型的关键因素之一。对这些成纤维细胞的进一步分析显示，约38%的细胞同时检测到IL6/TIMP1/ PLA2G2A和CHI3L1转录本，这表明HE-Fibro有共同的调节机制。我们推测CHIL3L1是通过表达促炎和ECM基因共同改善创面修复而驱动he – fiber愈合表型的关键因素之一。
参考文献：